Science：张峰等人发现CRISPR在非编码基因组中的应用

两个独立的研究小组分别证明了基于 CRISPR 的技术可以用于识别疾病相关基因的关键调控元件

来自麻省理工学院，Broad研究院等处的研究人员利用一个大型单导向RNA（sgRNA）文库，发现了影响癌症患者耐药性的基因的非编码调控元件，这一重要的发现公布在9月29日的Science杂志上，同期杂志的另外一项独立研究采用了一种高通量 CRISPRi 筛选技术，也在距离两种疾病相关基因1Mb（兆碱基）处发现了非编码元件。

这两项研究延伸了CRISPR在基础研究中的应用，分别扩展了 CRISPRi和 CRISPR/Cas9 非编码基因组筛选的应用范畴。

张锋研究组成果

在第一项研究中，Broad研究院的张锋研究组采用18,000 sgRNAs文库在三个基因（CUL3，NF1 和NF2）周围100个碱基范围内完成了一项715个碱基的CRISPR/Cas9 筛选。从中他们发现一些非编码位点，这些位点如果发生突变，就会导致其中一个基因表达量降低。

之前的研究表明这些基因的功能缺失突变与癌症药物 vemurafenib的耐药性有关，这种药物能用于治疗BRAF V600E突变的转移性黑色素瘤，因此调控这些基因的启动子和增强子元件备受关注。

这个研究组采用的方法并不是合成单个的 sgRNAs，而是将个体RNAs打印在类似杂交研究中的固体芯片上，然后切开RNAs，克隆进慢病毒载体中。

研究人员在每个携带BRAT基因突变的人黑色素瘤细胞中转入一个sgRNA，然后分别在对照组和vemurafenib组培养基中培养细胞。利用深度测序寻找药物组细胞中富集的CRISPR 突变基因位点，结果他们找到了上百个突变位点，大多数集中在靶标基因的5’末端，这些突变会降低基因表达，此外研究人员还发现CUL3周围25个位点中有24个会导致基因转录减少，和vemurafenib耐药性。

“相比于蛋白编码基因序列，我们对于非编码调控元件的了解太少了，”文章作者，纽约基因组中心的Neville Sanjana说，“我们这项研究，与其它基因编辑筛选都可以帮助大家发现调控基因组这一重要组成部分的分子规则。”

此外，令研究人员感到惊讶的是，在这项研究中发现的非编码调控元件，大部分是之前通过传统技术进行染色质区域研究中从未发现过的。

Lander研究成果

与张锋研究组不同，Lander等人利用的是一个称为KRAB结构域的蛋白片段与Cas9融合的休眠形式，来沉默他们的靶标。在这上百个调控元件中，研究人员仅仅只发现了两个调控GATA1基因的增强子元件，和七个调控MYC表达的增强子元件。

Engreitz说，“我们的研究结果提出了更多的新问题，那就是这些调控元件如何相互作用的。也许它们之间的二阶效应对于确定基因表达的精确水平至关重要。”

这两个研究组也得到了芯片技术的验证（染色质分析，三维构象捕获，转录因子分析），说明了利用CRISPR工具追踪非编码调控网络的可能性。Lander研究组发现并标记了MYC 和GATA1增强子区域，张锋研究组在CUL3周围发现了众多增强子和转录因子结合位点。

他们的研究通过新工具都发现了调控元件，这为进一步了解遗传突变与人类疾病的关联奠定了基础，同样Engreitz也认为如果能再多完成一些这样的实验，就能揭开整个基因组中全部调控网络的基本规则。

天然状态研究基因序列

虽然与传统分析方法的原理差不过，都是将靶标序列与质粒中报告基因相匹配，但是这些集中的 CRISPR筛选有一个明显的不同之处：它们直接靶向序列的天然状态。

“这些筛选针对的是周围序列都存在情况下的基因组序列，”Sanjana说，“报告基因分析非常有用，但是它们缺少天然基因组环境中的三维构象和本地染色质环境。在最新研究中，调控序列都是在正常的相互作用环境。”

“举例来说，我们在基因启动子和基因上千碱基外的非编码位点之间看到了长程的环，如果仅仅是单独来看，就会错过这些有趣的三维相互作用。”

不过，CRISPR技术从目前的情况来看也不是全能的，Engreitz说，“也许它现在还不能打断增强子，真正理解一个基因如何受到调控的，因此不得不再进行更多的切割，我们现在无法做到这一点。”

而且相比于CRISPR/Cas9，CRISPRi即使能分析更大片段（大约200个碱基），但功能元件的识别精确度受到影响。这两项研究都受限于sgRNAs的精确靶向。

虽然如此，几位研究人员都相信CRISPR技术在非编码基因组研究中能发挥重要的作用。目前张锋实验室正在发展CRISPR/Cas9基因组筛选改进方法，希望能将其扩大到更长的基因组中。

各家点评

虽然之前研究人员曾利用 CRISPR/Cas9 系统直接检验体内非编码基因组元件，但目前的研究大多集中在大型筛选识别新的非编码位点。

加州大学洛杉矶分校的合成生物学家Sriram Kosuri认为，“这（两个CRISPR筛选研究）完成了迄今为止很难做到的靶向工作，也就是天然人类基因组中与重要表型相关序列中的非编码区域。”

“研究人员从一种全新的角度，超越之前研究，利用 CRISPR工具解析了基因表达途径，找到了遗传途经如何影响耐药性的分子机制，”来自耶鲁大学医学院的基因组研究员Sidi Chen点评道。

MD安德森癌症中心的癌症基因组研究员Traver Hart则认为，“这是第一次在基因组中系统直接的分析增强子区域。”

原始出处：

C.P. Fulco et al., “Systematic mapping of functional enhancer-promoter connections with CRISPR interference,” Science, doi:10.1126/science.aag2445, 2016.

N.E. Sanjana et al., “High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome,” Science, doi:10.1126/science.aaf8325, 2016.