临床研究｜我国部分地区慢性HBV感染者HDV感染情况调查

丁型肝炎病毒(HDV) 是δ病毒科δ病毒属的唯一成员，是一种缺陷病毒，需要乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 参与才能复制和组装成完整病毒体^[1]。HDV通过与HBV相同的钠离子-牛磺胆酸共转运多肽(NTCP) 受体进入肝细胞^[2]。虽然HDV从发现至今已40余年，但科学界和公众对其关注有限^[3]。我国1992年和1996年的HDV流行率调查结果显示，HBsAg携带者HDV抗体流行率分别为1.15%和1.46%^[4-5]。

此后，我国暂无全国性的HDV流行情况调查数据。近年来，多篇系统综述^[6-7]研究结果显示，我国HBsAg携带者HDV抗体流行率为2.1%~5.57%，远高于早期报道结果。HBV感染者感染HDV表现为HBV/HDV联合感染和重叠感染2种形式^[8]。有研究^[9]认为，慢性丁型肝炎是导致终末期肝病的重要原因，70%的慢性丁型肝炎患者在确诊后5~10年可进展为肝硬化，15%的患者仅需1~2年即可进展为肝硬化^[10]。与HBV单独感染者相比，HBV/HDV合并感染者肝细胞癌(HCC) 发生风险与死亡风险更高(OR值分别为1.97、2.05)^[11]。

另外，对于慢性乙型肝炎、乙型肝炎相关肝硬化和乙型肝炎相关肝癌患者，其感染HDV的风险分别是无症状HBsAg携带者的3.56倍、6.75倍和5.61倍^[11]。目前我国为HBV中度流行国家，约有7 000万慢性HBV感染者，其中慢性乙型肝炎患者2 000万~3 000万，HBV相关肝硬化和HCC患者分别为100万和30万^[12]。因此，有必要对HBV感染者的HDV感染情况进行筛查，以利于指导患者的临床管理和治疗。刘慧敏等^[13]发现，近10年间，我国西南医院HBsAg阳性患者的HDV筛查率仅1.6% (13 585/832 144)，建议加大筛查力度，重视丁型肝炎。由于系统综述研究结果差异大，大样本的真实世界研究开展少，所以目前我国HDV的真实流行情况仍未知。本研究对我国10个省市自治区12家医院收集的慢性HBV感染者血清标本进行检测，了解我国不同地区HBV感染者的HDV感染流行情况。

1、资料与方法

1.1   研究对象

2021年3月—2022年6月，从全国10个省、自治区和直辖市的12家医院共收集HBsAg阳性慢性HBV感染者(包括HBsAg阳性携带者、慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者和乙型肝炎肝癌患者) 血清3 131例，其中赤峰市传染病防治医院500例，内蒙古国际蒙医医院300例，呼和浩特市第二医院86例，哈尔滨医科大学附属四院400例，吉林市传染病医院100例，北京市佑安医院708例，中南大学湘雅二医院200例，广西医科大学第一附属医院203例，安徽省立医院217例，新疆维吾尔自治区中医医院226例，西安交通大学第一附属医院135例，成都市公共卫生临床医疗中心56例。血清标本采集后于-20 ℃冰箱保存，通过冷链运输至北京大学医学部病原生物系实验室。HBsAg阳性携带状态、慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化的诊断参照《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版) 》^[14]，乙型肝炎肝癌的诊断参照《原发性肝癌诊疗规范(2019年版) 》^[15]。同时，收集患者的基本人口学信息，以及乙型肝炎血清学指标5项、HBV DNA、肝功能、HCV和HIV检测结果等。

1.2   抗-HDV IgG检测

应用万泰抗-HDV IgG试剂检测全部3 131例血清标本，其中500例血清标本并用贝尔抗-HDV IgG试剂检测(包括来自内蒙古标本450例、北京30例、湖南20例，其中含有全部万泰试剂检出抗-HDV IgG阳性标本)，2种试剂均获得北京食品药品监督管理局批准。严格按照各厂家说明书进行操作。任一试剂检测结果呈阳性即认为该标本抗-HDV IgG阳性。

1.3   HDV RNA检测

采用德国Qiagen公司“QIAamp Viral RNA Mini Kit”对抗-HDV IgG阳性标本进行HDV RNA提取。应用巢式逆转录聚合酶链式反应(nRT-PCR) 扩增部分HDV基因序列，先采用赛默飞世尔公司逆转录试剂“RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit”将HDV RNA转录为cDNA；然后采用翌圣生物科技公司“Hieff Canace^Ⓡ Gold High Fidelity DNA Polymerase高保真DNA聚合酶”进行nRT-PCR反应。严格按试剂说明书进行操作。nRT-PCR引物见参考文献^[16]，第一轮引物序列为：HDV-819 (5′-TCC CTT AGC CAT CCG AGT GGA C-3′) 和HDV-1303 (5′-AGG GTT CAC CGA CAA GGA GAG G-3′)。第二轮引物序列为：HDV-856 (5′-GGA TGC CCA GGT CGG ACC G-3′) 和HDV-1282 (5′-AAG GAA GGC CCT CGA GAA CAA G-3′)。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.4   HDV基因型检测

将抗-HDV IgG阳性标本的nRT-PCR产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行序列测定。采用Bioedit软件对测序结果进行预处理；从NCBI GenBank数据库下载8个HDV基因型的参考序列(见参考文献^[17])，采用MEGA 7.0软件构建基于邻位连接法的系统发育树进行基因型分析。

2、结果

2.1   慢性HBV感染者抗-HDV IgG阳性率

本研究共采集到3 131例慢性HBV感染者血清，共检出抗-HDV IgG阳性血清标本22例(0.70%)，其中内蒙古自治区886例标本检出抗-HDV IgG阳性标本16例(1.81%)；北京市708例标本检出2例(0.28%)；湖南省200例标本检出2例(1.00%)；新疆维吾尔自治区226例标本检出2例(0.88%)，其余省市自治区均未检出抗-HDV IgG阳性标本。慢性HBV感染者的抗-HDV IgG阳性率及地理分布见图1。经χ²检验，内蒙古自治区的抗-HDV IgG阳性率显著高于北京市 (P=0.004) 和其他地区(除内蒙古外的其余9个地区) (P＜0.001)，其余地区间抗-HDV IgG阳性率比较均无显著差异(P值均＞0.05)。

图1  我国部分地区慢性HBV感染者HDV感染流行率

对各类慢性HBV感染者分层分析，发现内蒙古地区的慢性乙型肝炎患者和乙型肝炎肝硬化患者抗-HDV IgG阳性率显著高于其他地区[慢性乙型肝炎: 1.71% (9/525) vs 0.31% (4/1 298), P=0.003; 乙型肝炎肝硬化: 6.06% (2/33) vs 0.23% (1/437), P=0.014]。对内蒙古地区有明确诊断的720例各类慢性HBV感染者的抗-HDV IgG阳性率比较，发现HBsAg携带者、慢性乙型肝炎患者和乙型肝炎肝硬化患者的抗-HDV IgG阳性率逐渐升高，分别为0.63% (1/160)、1.71% (9/525)和6.06% (2/33)，但各类型患者的抗-HDV IgG阳性率比较无显著差异(P值均＞0.05)，2例乙型肝炎肝癌患者抗-HDV IgG均阴性(表1)。其他地区(除内蒙古外的其余9个地区)抗-HDV IgG阳性患者较少(5例)，有明确诊断的2 106例慢性HBV感染者中，各类患者的抗-HDV IgG阳性率比较均无显著差异(P＞0.05)。

2.2   抗-HDV IgG阳性标本HDV RNA检测

22例抗-HDV IgG阳性标本经nRT-PCR检测，有19例HDV RNA阳性，内蒙古自治区标本HDV RNA阳性率为1.69% (15/886)，北京市标本为0.14% (1/708)，湖南省标本为0.50% (1/200)，新疆维吾尔自治区标本为0.88% (2/226)。各省市自治区HDV RNA阳性标本检出情况见图1。内蒙古自治区标本HDV RNA阳性率明显高于北京市(P=0.002) 和其他地区(除内蒙古外的其余9个地区) (P＜0.001)。对19例HDV RNA阳性标本进行序列测定，利用MEGA 7.0软件构建基于邻位连接法的系统发育树，结果显示，19条HDV序列均与HDV-1型聚类成簇，属于HDV基因1型。

2.3   HDV感染者临床特征分析

2.3.1   总体HDV感染者临床特征分析

根据抗-HDV IgG检测结果，对慢性HBV感染者的临床特征进行统计分析，因部分患者临床信息缺失，在表2中已标出每项检查有数据患者的例数(n)。3 131例患者中，抗-HDV IgG阳性22例，阴性3 109例。抗-HDV IgG阳性组与阴性组的年龄及性别差异均无统计学意义(P值均＞0.05)。研究共采集到1 702例患者的抗病毒治疗史信息，其中71.21% (1 212/1 702) 进行过抗病毒治疗，抗-HDV IgG阳性组抗病毒治疗率为90.91%(10/11)，阴性组为71.08%(1 202/1 691)；同时阳性组HBV DNA为1.48 (1.48 ~ 2.95) log₁₀ IU/mL，阴性组为2.00 (1.30 ~ 3.43) log₁₀ IU/mL，组间差异均无统计学意义(P值均＞0.05)。共收集到2 826例患者的临床诊断信息，诊断为乙型肝炎相关肝硬化/肝癌患者共684例，其中抗-HDV IgG阴性组681例，抗-HDV IgG阳性组3例，两组比较无统计学差异(P＞0.05)。根据慢性HBV感染者民族信息分为汉族、蒙古族和其他少数民族，经Fisher精确检验，抗-HDV IgG阳性组蒙古族患者的比例(47.37%, 9/19) 明显高于抗-HDV IgG阴性组(5.47%, 125/2 287) (P＜0.001)。其余指标(如HBV感染相关指标、肝功能指标) 在两组间的比较均无统计学差异(P值均＞0.05)。

2.3.2   内蒙古自治区HDV感染者临床特征分析

本研究检测出的抗-HDV IgG阳性患者主要来自内蒙古地区，所以对内蒙古地区抗-HDV IgG阳性和阴性慢性HBV感染者的临床特征进行比较分析。本研究共采集到内蒙古自治区慢性HBV感染者血清886例，抗-HDV IgG阳性组16例，阴性组870例，性别和年龄在两组间比较无统计学差异(P值均＞0.05)。抗-HDV IgG阳性组蒙古族患者占比60.00%(9/15)、ALT异常(ALT＞40 U/L) 患者占比57.14%(8/14)、进行过抗病毒治疗患者占比87.50%(7/8)，均显著高于阴性组(P值均＜0.05)。而抗-HDV IgG阳性组患者的HBV DNA水平中位数[1.90(1.48~3.07) log₁₀ IU/mL] 显著低于阴性组[2.85(1.48~5.00) log₁₀ IU/mL, P=0.030](图2)。其余指标如AST、ALP、GGT、HBsAg、HBeAg等在抗-HDV IgG阳性和阴性组间均无显著差异(P值均＞0.05)。

图2  内蒙古地区抗-HDV IgG阳性和阴性慢性HBV感染者临床特征比较

3、讨论

HDV通过HBV/HDV联合感染或重叠感染2种形式导致急性或慢性丁性肝炎，加速乙型肝炎患者的疾病进展^[18]。7%~14%的HBV/HDV重叠感染者或2%~3%的HBV/HDV联合感染者可发展为重症肝炎，90%的HBV/HDV重叠感染者或2%~5%的HBV/HDV联合感染者可转为慢性丁型肝炎^[19]。慢性丁型肝炎是最严重形式的病毒性肝炎，且疾病进展迅速^[20]。由于丁型肝炎无特异性疾病表现，若未进行HDV检测，难以区分单纯乙型肝炎和HBV/HDV联合或重叠感染，因此，有必要对HBV感染者进行HDV感染筛查，使HBV感染者知晓自己的HDV感染情况，有利于丁型肝炎患者的进一步临床管理和治疗。

目前，无论是欧美国家还是我国的HDV筛查率均较低，这也是很多国家无法获得准确HDV流行病学数据的原因之一^[13, 21-22]。一些国际指南^[23-25]建议对所有慢性HBV感染者或有HDV感染风险因素的HBsAg阳性患者进行HDV感染筛查。当下，丁型肝炎治疗药物研发已取得很大进展，HDV进入抑制剂——Hepcludex于2020年7月获得欧洲药品管理局有条件批准上市，用于治疗血浆(或血清) HDV RNA阳性的代偿期成人慢性丁型肝炎，其他靶点抗HDV治疗药物的临床试验也在推进^[26]。因此，及时掌握HDV感染流行情况，识别HDV感染者，可使患者尽早纳入临床管理，控制病情发展，减少终末期肝病发生，也有利于实现世界卫生组织提出的2030年消除病毒性肝炎公共卫生危害的目标^[3]。

系统综述研究^[6-7]结果提示，我国HBsAg携带者HDV抗体流行率有所上升，但不同研究结果差异较大，我国现阶段真实的HDV感染流行情况仍需进一步研究。Roggenbach等^[27]收集了我国11个省市自治区的3 065例HBsAg阳性患者血清，对HDV流行情况进行分析，结果显示，内蒙古自治区和新疆维吾尔自治区HDV流行率偏高，分别为13.9%和3.9%，其余9个省市未检出HDV抗体阳性标本。王彦^[28]对我国7个省市自治区的3 000例慢性乙型肝炎患者进行HDV流行情况调查，发现单独慢性乙型肝炎患者的HDV流行率为0.85%，HIV/HBV合并感染者的HDV流行率为7.91%，四川省(13.88%) 和广西壮族自治区(5.32%) HDV流行率偏高，与纳入研究的HIV/HBV合并感染者比例高有关。

本研究对来自全国10个省市自治区的3 131例慢性HBV感染者进行HDV感染情况调查，发现内蒙古自治区、北京市、湖南省和新疆维吾尔自治区慢性HBV感染者的抗- HDV IgG阳性率分别为1.81%(16/886)、0.28%(2/708)、1.00%(2/200)和0.88%(2/226)，其余地区未检出，总体抗-HDV IgG阳性率为0.70%(22/3 131)。内蒙古自治区慢性HBV感染者抗-HDV IgG阳性率较高，并且蒙古族患者阳性率显著高于汉族和其他民族，其原因可能与民族习惯有关，蒙古族使用刀具的机会较多，这可能会使当地人感染血源性传播疾病的可能性增加，导致HDV流行率较高；也可能与地理位置毗邻HDV高流行区(蒙古国) 有关^[27]。王彦^[28]研究报道，少数民族(以彝族为主) HDV感染者的比例也明显高于汉族。以上研究结果提示，HDV在我国处于低流行态势，不同地区HDV流行率差异大，高风险人群的HDV流行率高。不同研究对同一地区筛查得出的HDV流行率存在差别，可能与研究的地理区域、纳入研究的人群类别及使用的HDV抗体检测试剂不同有关。

另外，本研究在内蒙古地区慢性HBV感染者中发现，HBV/HDV合并感染者接受抗病毒治疗比例高、HBV DNA水平显著低于HBV单独感染者，而ALT异常患者比例显著高于HBV单独感染者。Jang等^[29]发现与单独慢性乙型肝炎患者相比，合并HDV感染的患者在抗HBV治疗1年和2年后ALT异常的风险分别增加30倍和10倍。既往研究^[28, 30-31]也发现，HDV感染可抑制HBV复制或HBeAg表达，HDV感染者ALT水平反复波动，ALT异常患者比例更高，可能与HDV感染后进一步加重乙型肝炎患者肝损伤有关。因此，建议对抗病毒治疗后无生化学应答的慢性乙型肝炎患者，尤其是HBV DNA低水平患者，进行HDV感染相关检查。但Liao等^[32]发现，对慢性乙型肝炎患者，HDV感染者的HBV DNA水平明显低于HBV单独感染者；而对终末期肝病患者，HDV感染者的HBV DNA水平却明显较高，可能提示HDV抑制HBV复制与肝病进展情况有关。

本研究存在一些不足之处。由于本研究为多中心研究，各医院开展的检测项目有差异，收集的临床资料不够完善，部分患者检测项目信息缺失，给临床数据分析造成影响。其次，本研究中大部分患者都接受过乙型肝炎抗病毒治疗，重症肝病患者比例少，可能会影响HDV流行率的估计。除用于治疗乙型肝炎外，聚乙二醇干扰素(PEG-IFNα) 是目前国外指南唯一推荐用于治疗丁型肝炎的药物，持续病毒学应答率为20%~30%^[10, 33]。因此，对于使用PEG-IFNα治疗的乙型肝炎患者，若合并HDV感染，也有一定治疗效果。核苷(酸) 类似物是另一类用于治疗乙型肝炎的药物，虽然对丁型肝炎无治疗效果或效果甚微，但可有效控制乙型肝炎患者的病情进展^[34]。研究^[35]认为，HDV抗体阳性率随肝病严重程度而明显增加，在轻症肝病患者中发现HDV抗体阳性患者的概率小。

另外，本研究未招募到高风险人群(如HIV、HCV感染者，静脉吸毒者，高风险性行为者等)，而有研究^[6]发现，这部分人群的HDV感染率显著高于普通HBV感染者。

综上所述，本研究中3131例慢性HBV感染者的HDV IgG抗体流行率为0.70% (22/3 131)，不同地区HDV流行率差异大，内蒙古自治区抗-HDV IgG抗体阳性率(1.81%) 相对较高。HDV RNA阳性感染者的HDV基因型均为1型。本研究发现我国部分地区HDV流行率较低，但考虑到HDV流行的地区差异、人群差异和HDV感染后的疾病特点，建议对重点地区和高风险人群加大HDV筛查力度，使丁型肝炎患者能获得及时有效治疗；在开展全国乙型肝炎血清流行病学调查时，对HBsAg阳性人群检测抗-HDV IgG，了解我国一般人群的抗-HDV IgG流行率。

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刘玉梅, 郭小平, 张慧敏, 等. 我国部分地区慢性HBV感染者HDV感染情况调查[J]. 临床肝胆病杂志, 2023, 39(4): 795-803.