Biomed Pharmacother：补肾中药让小鼠返老还童，延年益寿！

生物老化是一个涉及多种因素的复杂过程，其特点在于分子和细胞层面的渐进性改变以及生理功能的逐渐恶化。研究揭示，衰老所展现的分子和细胞特征，例如表观遗传变化和细胞衰老，能够显著促进与年龄相关的进程，并在啮齿动物和/或灵长类动物中导致健康寿命的缩短。其中，DNA甲基化作为一种主要的表观遗传修饰方式，其变化被认为是老化的重要标志之一。然而，DNA甲基化水平在生物体的整个生命周期中呈现动态变化，这种变化不仅受到外部刺激如紫外线照射、化学损伤、药物等因素的影响，还与生物体内部的老化过程紧密相连。

中医在慢性病治疗领域拥有深厚的历史底蕴。八子补肾胶囊作为一种由14种中草药精制而成的药物（菟丝子、枸杞子、五味子、蛇床子、金樱子、覆盆子、韭菜子、川楝子、淫羊藿、巴戟天、肉苁蓉、地黄、川牛膝、人参、鹿茸、海马），其成分涵盖了珍贵的人参和其他中草药。该药物最初的设计初衷是为了缓解人体疲劳。然而，近期的研究进一步揭示了八子补肾胶囊在年龄相关疾病模型中的独特疗效。研究显示，八子补肾胶囊能够通过调节炎症反应和抑制氧化应激诱导的细胞凋亡，有效减少Ovx/ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的面积，从而展现出其在慢性病治疗领域的应用潜力。

日前，一篇名为“Bazi Bushen mitigates epigenetic aging and extends healthspan in naturally aging mice”的文章揭示了八子补肾胶囊在抗衰老中的价值。

图1 论文首页

BZBS可以提高自然衰老小鼠的记忆和肌肉耐力

为了验证BZBS在自然衰老过程中对中枢神经系统具有保护作用，研究者对雄性C57BL/6 J小鼠进行了为期3个月的治疗实验。实验分为多个组别，包括BZBS高剂量组（2g/kg/天）、BZBS低剂量组（1g/kg/天）以及对照组（仅进行溶解处理）。实验期间，小鼠的年龄大致相当于人类的44岁至50岁。同时，研究还设立了雷帕霉素治疗组（4mg/kg/2天）作为阳性对照。

巴恩斯迷宫试验（图2A-D）结果显示，与对照组相比，BZBS治疗组和雷帕霉素治疗组的潜伏期、总时间和总距离均显著降低，且降低程度相近。这一结果表明BZBS治疗能够改善小鼠的记忆能力。此外，研究者还评估了这些小鼠的肌肉表现。结果显示，仅有BZH组的旋转时间和距离显著增加（图2E-F）。因此，选择了2g/kg/天的BZBS治疗方案进行进一步的研究。虽然雷帕霉素治疗组在肌肉耐力方面并未观察到明显的提升，这可能是由于给药时间有限所导致的。这些数据表明BZBS在自然衰老小鼠的健康寿命延长中具有潜在的积极作用。

图2 BZBS对认知能力改善和肌肉表现的影响

BZBS治疗小鼠肝脏甲基化组的分析

主成分分析（PCA）显示，三组之间存在明显的整体分离。这进一步验证了衰老过程和药物治疗过程中，DNA甲基化模式发生了显著的变化（图3A）。当与幼龄小鼠相比，老年小鼠的总mCpG水平（包括平均值和中位数）显著降低。但BZBS治疗成功地逆转了这种年龄依赖的甲基化下降，特别是在启动子区域，其效果十分显著（图3B）。

在深入研究这些变化的过程中，研究者注意到差异甲基化区域（DMRs）可能是基因组的关键功能区域。在这些区域内，多个相邻的CpG位点呈现出差异甲基化，进而参与到基因转录调控的过程中。为了更系统地定义这些DMRs，研究采用了甲基KitR包对样本进行了详细的比较，并严格筛选了那些具有显著p值且甲基化差异至少为5%的常染色体。

经过这一系列的筛选和分析，研究在“young vs aged”配对组中成功鉴定出了60,2087个DMRs。与整体mCpG水平的变化趋势相反，年轻组中只有5.91%的DMRs呈现出高甲基化状态，而有14.05%的DMRs则表现为低甲基化（图3C）。另一方面，在“BZH vs aged”对组中，研究发现了49,0237个DMRs。在这些DMRs中，经过BZBS处理的老年小鼠有4.1%的DMRs呈现高甲基化状态，而有16.23%的DMRs则呈现低甲基化状态（图3D）。

综上所述，BZBS治疗能够有效地逆转老年小鼠年龄依赖性的甲基化改变。

图3 BZBS逆转与年龄相关的DNA甲基化下降

BZBS促进DNA甲基化年轻化，并延长自然衰老小鼠的健康寿命

为进一步提高模型在更广年龄范围的预测精准度，研究者整合了来自24至120周龄小鼠的开源RRBS数据（图4A）。最终，精心筛选出399个关键位点及其对应的beta值，用以构建和优化实验模型。在训练集和测试集的自然衰老小鼠样本中，研究者观察到了一个显著且稳定的“实际年龄与甲基化年龄”之间的线性关系。这一关系在训练集中呈现出R值为0.992的高相关性，而在测试集中更是达到了R值为0.994的卓越表现（图4B）。这些结果无疑证明了新算法具有极高的准确性。

值得一提的是，在接受BZBS治疗的老年小鼠中，研究发现其DNA甲基化周龄相较于对照组显著年轻约21周。具体来说，BZBS治疗组的老年小鼠DNA甲基化周龄为36.59周（标准差为5.96周），而对照组的老年小鼠则为57.63周（标准差为2.15周）（图4C）。老年肝脏常常伴随着炎症和纤维化等病理特征的增加。有趣的是，与DNA甲基化衰老减缓的现象相一致，通过H&E和Masson染色的肝脏切片观察，研究发现BZBS处理的老年小鼠在炎症和纤维增生方面相较于对照组表现出了明显的减轻（图4D、E）。

因此，结合先前关于认知和运动能力改善的研究发现，有理由相信BZBS在延长健康寿命方面发挥着重要作用。

图4 BZBS可以恢复DNA甲基化的年龄，并延长老年小鼠的健康寿命

体外实验揭示了BZBS在衰老细胞中的直接甲基化调节功能

为深入探究BZBS对衰老过程中DNA甲基化调控的影响，研究者在HUVECs细胞中评估了其甲基化酶调控的作用。初步以MTS法评估BZBS提取物的细胞毒性，结果显示所有浓度均未对细胞活力产生显著影响（图5A）。随后，研究者成功构建了辐照诱导的衰老HUVEC模型。与先前的研究结果一致，短暂的6 Gy照射不仅显著改变了HUVEC细胞的形态（核面积增加），还诱导了衰老标志物的上调（图5B-F）。值得注意的是，与研究者在老年小鼠肝脏中观察到的现象相似，衰老的HUVECs同样表现出DNMT1和TET1表达水平的显著降低（图5G、H）。

经过BZBS提取物处理后，研究者发现仅高剂量能提升DNMT1的表达水平（图5G）。然而，TET1的表达调控似乎对BZBS提取物更为敏感，仅需25μg/mL的BZBS提取物即可挽救TET1的表达，而250 μg/mL的BZBS提取物甚至能进一步升高其表达（图5H）。这些结果强烈暗示BZBS对DNA甲基化具有直接的调控作用。考虑到HUVECs作为人类内皮细胞，是构成血管的重要组成部分，遍布全身，包括肝脏。因此，该研究对衰老HUVECs的体外实验结果为此配方在多个衰老的人体组织中具有保守的甲基化调节作用提供了有力证据。

图5 BZBS提取物对衰老HUVEC中甲基化酶的调控

结论

该研究经过严谨的实验，发现BZBS通过DNA甲基化-衰老逆转机制发挥抗衰老作用的现象。尽管目前仍存在一些待解决的问题，但这些发现无疑为BZBS在抗衰老治疗领域的应用提供了重要依据，充分展现了其潜在的重要性和价值。

参考文献：

Mao X, Hou Y, Fang C, Ma K, Zhang S, Guo Z, Kang N, Niu K, Shen X, Li Y, Jiang Y, Song Y, Wang L, Li H, Chang L, Wei C, Wu Y, Li M. Bazi Bushen mitigates epigenetic aging and extends healthspan in naturally aging mice. Biomed Pharmacother. 2023 Apr;160:114384. doi: 10.1016/j.biopha.2023.114384