一波新的CRISPR工具浮出水面

2017年3月28日/生物谷BIOON/---当你读到这篇文章时，又一波CRISPR工具将会浮出水面。它们将需要接受测试和优化。不过，如果你询问开发者你在开展概念验证研究时是否应当试用它们时，你将仅获得鼓励。毕竟，迄今为止它们还不能从Addgene公司获得，但是将会很快上市了。

最新发布的一系列CRISPR工具包括新的谱系追踪方法，该方法能够提供一种窗口来研究发育的最早阶段。如今，针对最为流行的酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）核酸内切酶Cas9，人们可以获得新的Cas9抑制剂，在多种情形下用于阻止脱靶效应。其他的策略将CRISPR-Cas9系统与前沿的单细胞测序技术组合在一起。与此同时，除Cas9之外，研究人员发现有前景的新的效应酶（如C2c2），这些效应酶靶向RNA用于编辑和成像等用途。

《科学家》杂志报道了所有的这些进步，在这里，我们请求开发者针对如何在你自己的实验室中使用这些热门的技术提供建议。下面就是他们给出的建议。

（一）CRISPR-Cas9抑制

研究人员：加州大学旧金山分校教职研究员Joseph Bondy-Denomy

背景：鉴于已知Cas9核酸内切酶在细胞内逗留太久会导致脱靶效应，科学家们正在努力开发Cas9关闭开关。Bondy-Denomy说，“目标就是有一种方法关闭它，而不是依赖于它被动地降解。”在理想的情况下，Cas9会发现完美的靶标，随后一种Cas9抑制剂阻止这种酶发生额外地切割。

方法：Bondy-Denomy团队发现4种新的Cas9抑制剂，结果发现其中的两种抑制剂（AcrIIA2和AcrIIA4）能够阻断广泛使用的酿脓链球菌Cas9的作用，而且这些抑制剂不同于早期发现的在其他的CRISPR-Cas系统中发挥作用的多种关闭开关[1][2][3][4][5]。这种研究来自该团队的观察：在细菌和入侵它们的病毒之间的斗争当中，某些宿主细菌，如食源性致病菌单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes），能够将病毒DNA插入到它们的CRISPR阵列（CRISPR array）中，因此，它们的CRISPR-Cas9系统具有完美匹配病毒DNA的序列，但是仍然不能够阻止病毒入侵。正是Cas9抑制剂导致这种现象，而且Bondy-Denomy团队继续寻找更多的Cas9抑制剂。

一种可能的应用是将Cas9抑制剂与不能切割的CRISPR工具CRISPRi[6][7][8]或CRISPRa[9][10][11]结合在一起。CRISPRi被用来抑制特定基因的表达，而CRISPRa提高特定基因的表达。通过结合在一起，这些工具可能有朝一日允许用户进行基因表达或沉默。

正在开展：Bondy-Denomy团队计划在不久的未来通过Addgene公司提供携带所有这四种抑制剂的质粒。AcrIIA2和AcrIIA4可在人细胞系HEK293中使用，但是要记住一种细胞类型，一种靶标。不过，他说，“任何人能够利用他们最喜欢的酿脓链球菌Cas9版本试用这些抑制剂。可能Cas9版本1和Cas9版本3不在我们的设置中发挥作用，但会在其他人的设置中发挥作用。”

他说，就每名实验员而言，何时试用这些抑制剂将是不同的。因此，用户将需要自行检验任何众所周知的脱靶编辑是否下降或消失。当然，也要检验你的在靶效应。他说，“我们预计一些在靶效应会消失，但是迄今为止，我们并不知道哪些会消失。”

未来：Bondy-Denomy团队正在利用向导RNA（gRNA）测试这些抑制剂。gRNA是一段RNA序列，允许Cas9靶向基因组上的特定位点，而且已知因引入脱靶突变而造成问题。Bondy-Denomy说，这是比较重要的，这是因为科学家们经常遭遇困难：他们想要在特定位点上修复点突变，而且靶位点需要跟着前间区序列邻近基序（protospacer-adjacent motif, PAM）。PAM长2～6个碱基，紧跟着靶DNA位点，是Cas9结合到靶DNA上所必需的。这种所需的编辑应当会改变PAM序列，或者你冒着风险再次切割靶位点，从而破坏你的研究。因此，这些抑制剂提供一种机制让Cas9短暂地发挥作用。

（二）Perturb-seq
研究人员：加州大学旧金山分校细胞分子药理学系教授Jonathan Weissman和哈佛大学-麻省理工学院布罗德学院核心成员Aviv Regev。

背景：通过与正在扩大的CRISPR-Cas9工具箱一起使用，单细胞RNA测序在过期几年快速地取得进展。学者们已提出基于液滴的方法，而且首个商业平台正在网上上线。

方法：三篇发表在Cell期刊上的研究证实利用这种CRISPR-Cas9工具箱（可进行基因编辑和基因抑制）开展高通量单细胞RNA测序（RNA-seq）是可能的[12][13][14]。

Weissman和Regev的新技术被称作Perturb-seq，让它发挥作用的关键在于能够在单细胞转录组中编码基于CRISPR的扰动。大多数高通量单细胞RNA-seq依赖于捕获RNA的3’端PolyA尾巴，但是gRNA通常并不具有polyA尾巴，不能够被直接捕获。因此，Weissman团队的博士后研究员Thomas Norman和Britt Adamson设计出一种条形码策略来鉴定出这些gRNA。Adamson说，“如今，我们能够让细胞携带priori标记，对它们进行不同地处理，随后将这些标记与特定的扰动对应在一起。”另一个至关重要的步骤就是开发一种分析方法来解析大规模的数据。

正在开展：这些研究人员使用10X Genomics平台开展单细胞RNA-Seq。这种平台是如此之新以至于迄今为止很多人不能够使用它。但是Norman 说，Perturb-seq也可在96孔板中开展，而且也可使用Drop-seq方法。他补充道，重要的是，你应当能够使用你最喜欢的Cas9变异体。

他们用来给gRNA添加条形码和表达这些gRNA的载体将很快通过Addgene公司获得。Norman说，利用这种方法，研究人员能够（在理论上）将来自不同实验的细胞汇集在一起以便降低成本。数据分析能够在一种标准的计算集群中开展；但是注意到它将可能需要至少几个月的时间来分析这些数据。

未来：Weissman团队计划发布一种更加详细的程序，而且他和Regev团队将发布一些他们为这三项研究开发的计算工具。Adamson说，“我们想要使它们尽可能地为人们所使用。”

为了这个目的，Weissman团队也正在努力开发改进的文库制备程序，比如将目光缩小到一组更为有限的基因以便降低实验成本。与此同时，他们也正希望解决生物学障碍和逻辑障碍以便将测序规模扩大到整个编码基因组。

（三）归巢向导RNA
研究人员：美国加州大学圣地亚哥分校生物工程系助理教授Prashant Mali和美国哈佛医学院遗传学系教授George Church

背景：谱系追踪在发育生物学中发挥着至关重要的作用。在去年，几个研究团队利用CRISPR-Cas9方法追踪细胞命运。在单个细胞的发育期间，Cas9编辑会在它的基因组上聚集，所有的这些方法能够追踪这些编辑。

方法：这种最新的设计是一种归巢向导RNA（homing guide RNA），它引导Cas9到它自己的DNA位点（作为它的靶标）上，因而自我切割，从而有效地让Mali团队和Church团队在体外培养的细胞群体中能够追踪的条形码多样化。这种方法如此独特的原因在于这些编辑的归巢向导RNA保持自我靶向的能力，因此这些归巢向导RNA的寿命潜在地比用于其他的谱系追踪方法中的条形码更长。此外，鉴于这些条形码能够发生转录，科学家们能够利用荧光原位测序（Fluorescent In Situ SEQuencing, FISSEQ）等RNA检测方法潜在地读取它们。FISSEQ是由Church实验室开发出的一种方法[15]。不过，Mali指出这项新研究能够扩增和检测这些RNA而不是对它们进行测序[16]。

正在开展：Mali说，“基本上，这种工具是很容易实施的。它归结起来就是产生具有本身就存在的特定条形码的细胞。”检测不一定是通过FISSEQ开展的，任何单细胞测序方法都可能潜在地用于检测。

正如标准的gRNA那样，归巢向导RNA需要在实验中接受测试。一经切割就形成的一些自我突变会触发较大的序列插入或删除，从而消除它们的归巢活性。其他的自我突变仍然让归巢向导RNA能够长期地保持活性。Mali说，“针对你的特定应用，试图找到合适的混合和匹配将是至关重要的。”比如，如果你想要能够在多次细胞分裂时添加条形码，那么你需要 一种更长时间发挥作用的归巢向导RNA。他补充道，“至少从这刻起，我们对如何选择最好的归巢向导RNA还没有制定精确的规则。”

未来：在理论上，这些条形码能够产生数量足够的变异体以便涵盖整个小鼠大脑中的所有细胞类型。Mali团队当前的关注焦点是在体内开展他们的研究。

（四）切割RNA
研究人员：哈佛大学-麻省理工学院布罗德研究所核心成员Feng Zhang和美国国家卫生研究院高级研究员Eugene Koonin 背景：鉴于这是一种基因组编辑工具，常规的CRISPR-Cas9并不能够很好地研究许多种发生转录但从不会发生翻译的基因，也就是非编码基因组。能够直接操纵RNA允许人们更好地理解RNA和开发基于RNA的药物，如抗病毒药物。

方法：在一项概念验证研究中，Zhang团队和Koonin团队合作描述一种新的CRISPR效应酶C2c2，它在一种gRNA的引导下切割单链RNA上的特定靶位点，结果表明它能够降解大肠杆菌中的一种特定的mRNA[17]。这两个团队发现C2c2的很多其他的垂直同源基因（ortholog）。通过与多名合作者合作，他们正在研究这些垂直同源基因中的大约16种，并且在不同的应用中测试它们，如在活细胞中追踪RNA。

不同于抑制基因表达的RNA干扰工具，人们能够在细胞中定位C2c2。Zhang团队研究生Omar Abudayyeh说，“你能够让它进入细胞核，而且让它在那里发生降解作用。它成为一种强大的工具来探究这种非编码基因组。”

正在开展：这种携带C2c2的初始质粒（C2c2来自细菌Leptotrichia shahii）可通过Addgene公司获得，但是注意到它在哺乳动物细胞中的使用并未得到优化。Abudayyeh说，它更可能在细菌或非哺乳动物真核生物（比如植物）中发挥作用，不过迄今为止还没有试验过。

Abudayyeh说，即便针对当前的C2c2，当试图靶向一种转录本时，gRNA之间也存在变异性。这不仅因为这种序列本身，而且还因为这种转录本的可接近性。很多转录本具有二级结构，或者被遮盖这种序列的蛋白结合着。为了解决这个问题，Zhang团队提出给你的靶标提供很多均匀间隔的gRNA。此外，预测RNA结构的计算工具可能有助于了解你在一种特定靶标中取得多大的成功。

当然，检验蛋白表达来观察你的C2c2是否发挥作用是比较重要的。此外，Zhang和Regev在哈佛大学-麻省理工学院布罗德研究所的实验室研究生Jonathan Gootenberg说，他们经常给C2c2标记上一种抗体来检验它的表达。

未来：除了描述C2c2的新的垂直同源基因之外，Zhang团队和Regev团队正在开展guide-tiling阵列（guide-tiling array）以便制定一组规则来帮助人们预测gRNA的成功。guide-tiling阵列类似于芯片，其所使用的寡核苷酸探针是gRNA。（生物谷 Bioon.com）

本文系生物谷原创编译整理，欢迎转载！点击 获取授权 。更多资讯请下载生物谷APP。

新闻来源：
A Selection of CRISPR Proof-of-Principle Studies

参考资料：
1.Inhibition of CRISPR-Cas9 with Bacteriophage Proteins
Cell, 12 January 2017, doi:10.1016/j.cell.2016.12.009

2.Inactivation of CRISPR-Cas systems by anti-CRISPR proteins in diverse bacterial species
Nature Microbiology, doi:10.1038/nmicrobiol.2016.85

3.Bacteriophage genes that inactivate the CRISPR/Cas bacterial immune system
Nature, 17 January 2013, doi:10.1038/nature11723

4.A New Group of Phage Anti-CRISPR Genes Inhibits the Type I-E CRISPR-Cas System of Pseudomonas aeruginosa
mBio, 15 April 2014, doi:10.1128/mBio.00896-14

5.Multiple mechanisms for CRISPR–Cas inhibition by anti-CRISPR proteins
Nature, 01 October 2015, doi:10.1038/nature15254

6.Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression
Cell, doi:10.1016/j.cell.2013.02.022

7.CRISPR Interference Efficiently Induces Specific and Reversible Gene Silencing in Human iPSCs
Cell Stem Cell, doi:10.1016/j.stem.2016.01.022

8.A Comprehensive, CRISPR-based Functional Analysis of Essential Genes in Bacteria
Cell, doi:10.1016/j.cell.2016.05.003

9.Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation
Cell, doi:10.1016/j.cell.2014.09.029

10.Genome-scale transcriptional activationby an engineered CRISPR-Cas9 complex
Nature, doi:10.1038/nature14136

11.Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming
Nature Methods, doi:10.1038/nmeth.3312

12.Perturb-Seq: Dissecting Molecular Circuits with Scalable Single-Cell RNA Profiling of Pooled Genetic Screens
Cell, doi:10.1016/j.cell.2016.11.038

13.A Multiplexed Single-Cell CRISPR Screening Platform Enables Systematic Dissection of the Unfolded Protein Response
Cell, doi:10.1016/j.cell.2016.11.048

14.Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq
Cell, doi:10.1016/j.cell.2016.11.039

15.Fluorescent in situ sequencing (FISSEQ) of RNA for gene expression profiling in intact cells and tissues
Nature Protocols, doi:10.1038/nprot.2014.191

16.Rapidly evolving homing CRISPR barcodes
Nature Methods, doi:10.1038/nmeth.4108

17.C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector
Science, doi:10.1126/science.aaf5573