Cell Reports：大规模并行报告基因分析揭示疾病相关3' UTR突变可影响mRNA稳定性、翻译和癌症进展

导读

前列腺癌是第二大常见的男性恶性肿瘤，仅次于肺癌。转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）是前列腺癌的终末期，其对激素治疗有抗性，并具有转移能力，是造成患者死亡的主要原因。目前，人们对编码序列（CDS）突变、mRNA表达变化和基因组结构变异如何影响前列腺癌已有了解，但这些发现并不能全面解释疾病发病机制，致癌基因表达的转录后水平上还有许多地方有待探索。

3 '非翻译区（3' UTR）体细胞突变是了解癌症中异常基因调控的一个途径，但目前尚未被充分探索。3' UTR紧邻CDS下游的区域，其随基因转录但不翻译，该区域是mRNA稳定性和翻译的主要介质，通过基于序列和结构的元件富集反式作用因子。已有研究表明3' UTR可能是癌症基因失调的重要枢纽，但3' UTR突变如何影响癌症的转录后动态变化仍不清楚。

近期，美国华盛顿大学的研究人员在期刊Cell Reports上发表了题为“Multi-level functional genomics reveals molecular and cellular oncogenicity of patient-based 3' untranslated region mutations”的文章。研究团队在185个mCRPC患者中鉴定了3' UTR体细胞突变，发现了14,497个富含致癌通路和3' UTR调控元件的单核苷酸突变。通过两种互补的大规模并行报告基因分析（MPRA）方法，检测了数千个基于患者（patient-based）的突变，并发现影响mRNA翻译或稳定性的致癌3' UTR突变与更快进展为晚期疾病相关。

文章发表在Cell Reports

为研究3' UTR突变如何影响前列腺癌转录后基因表达，研究团队首先构建了一个以UTR为中心的测序数据库，包括185个mCRPC肿瘤的全基因组测序（WGS）或UTR测序数据（图1）。通过4个突变调用器来调用高置信度体细胞突变，最终共保留7,647个基因的14,497个3' UTR体细胞单核苷酸突变。研究团队还分析了上述3 ' UTR突变的稳健性，发现其遵循前列腺癌的预期模式，显示出强烈的C→T/G→A过渡突变的倾向。

研究团队观察到3' UTR突变在癌症相关基因集和通路中的显著富集，表明这些突变可能是异常致癌表达的重要来源。进一步，研究团队确定了几个具有高度3' UTR突变的癌症相关基因，其中，FLRT2和LPP中3' UTR突变负荷最高。LPP在调节转移和耐药性方面发挥作用，FLRT2在多种癌症中被认为具有抑制肿瘤的作用。

除分析3' UTR突变靶向的基因之外，研究团队还表征了单个3' UTR序列的突变模式，观察到突变沿3' UTR的长度均匀分布，并未在CDS或poly-A尾部附近富集。接下来，研究团队使用FishHook进行了显著性分析，发现队列中有两个3' UTR（CCL11和ZNF492）的突变频率高于预期。特别地，一种与肺癌和卵巢癌相关的趋化因子CCL11，在7名患者的12nt内存在4个3' UTR突变。上述结果表明，该研究确定了晚期前列腺癌肿瘤中3 ' UTR突变的情况，并揭示了癌症相关基因和顺式调控元件中大量潜在的有趣突变。

图1. mCRPC患者的癌症相关基因和调控元件中存在数千个3' UTR突变。

为从功能上评估患者突变影响转录后基因调控的效果，研究团队开发了基于多聚核糖体分析的MPRA，能够同时检测数千个突变如何改变翻译效率（TE）（图2）。结果显示，有180个3' UTR点突变显著改变了TE，动态范围超过1000倍。此外，计算TE的两种方法（使用总多聚核糖体相关mRNA或高多聚核糖体相关mRNA）的结果一致，总多聚核糖体显示出更大的功能突变库。

研究团队发现许多功能性3 ' UTR突变引起了看似致癌性的表达变化，或是增加致癌mRNA的TE，或是减少肿瘤抑制基因的TE。有趣的是，神经元基因的功能突变表现出富集，表明神经内分泌相关途径的失调，癌症相关基因集也出现了明显的富集，包括p53、Wnt等。上述结果表明3 ' UTR突变可造成多种致癌通路失调。

为确定上述3' UTR突变如何在分子水平上影响TE，研究团队分析了其是否改变了已知的调控序列（图2E）。结果显示，超75%的功能突变改变了RNA结合蛋白（RBP）和miRNA结合基序。具体来说，大多数突变发生在RBP结合位点，特别是结合富含AU和U基序的位点，包括hnRNPCL1、PUF60、RBM6和RC3H158。综上，MPRA揭示了患者来源的3 ' UTR突变对mRNA翻译的影响，并确定了这些突变通过改变序列元件来调节致癌表达的广泛重要性。

图2. 基于患者的3' UTR突变在功能上影响基因特异性翻译效率。

除了TE之外，3' UTR也是mRNA稳定性的重要介质。为确定mCRPC患者突变如何影响mRNA降解，研究团队使用体外转录（IVT）mRNA的RNA测序（RNA-seq）设计并实施了第二个互补性MPRA，并使用单独的双荧光素酶报告基因检测从外部验证了几个MPRA的结果（图3），发现了预期的蛋白质表达变化。具体而言，研究团队发现150个基于患者的3' UTR突变显著改变了mRNA稳定性，其中许多是已知的癌基因。

值得注意的是，影响mRNA稳定性的功能突变在神经元基因中丰富，结合先前的研究结果，这表明3 ' UTR突变可能是晚期前列腺癌中神经内分泌特征失调的另一种方式。此外，与影响TE的突变相同，大多数影响mRNA稳定性的3' UTR突变都会改变已知的RBP结合序列，特别是富含AU和U基序的序列，这表明许多RBP对mRNA翻译和稳定性具有双重影响。

图3. 基于患者的3' UTR突变显著改变致癌mRNA稳定性。

3' UTR突变已被发现可增加致癌表达和细胞生长，为了解这些突变如何影响患者预后，研究团队进行了深入分析（图4）。结果显示，与没有这些突变的肿瘤相比，携带任何致癌3' UTR突变的患者肿瘤进展为雄激素非依赖性（AI）的速度显著更快；这些患者发生骨转移的时间和总生存期也较短。

有趣的是，具有基于翻译的致癌3' UTR突变的患者表型较温和，显示出较出现AI的强烈趋势，但总生存期或转移没有变化。但基于稳定性的致癌3' UTR突变对患者预后有较大影响，携带该突变的患者预后显著较差。此外，与没有致癌3’UTR突变的患者相比，含有影响翻译或稳定性的致癌3’UTR突变的患者在进展时PSA（前列腺特异性抗原）水平更高，中位生存时间更短。

图4. 功能性致癌3' UTR突变与不良患者预后相关。

综上，该研究全面分析了疾病相关3' UTR突变对mRNA稳定性、翻译和癌症进展的影响程度，扩大了功能性癌症基因组学的界限，并有可能揭示先前未探索的调控区域的调控功能原理和潜在的治疗靶点。

文章作者、前列腺癌专家Andrew Hsieh医学博士表示：“这是有史以来第一次证明3' UTR中基于患者的突变可能会导致耐药性。当前列腺癌患者的肿瘤中出现这些突变时，肿瘤会更快地对激素阻断治疗产生耐药性，更快地在体内扩散，并且生存时间更短。”

参考文献；

chuster, S. L., Arora, S., Wladyka, C. L., Itagi, P., Corey, L., Young, D., ... & Hsieh, A. C. (2023). Multi-level functional genomics reveals molecular and cellular oncogenicity of patient-based 3′ untranslated region mutations.Cell Reports.

https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(23)00851-3