暨南大学孙平华/张江林/周海波ACS Nano：用于临床黑色素瘤筛查的可穿戴微针贴片原位检测酪氨酸酶

尽管酪氨酸酶（TYR）在皮肤黑色素瘤中有潜在的作用，但捕获皮肤中TYR的真实变化仍然是一个重要挑战。与传统的人体血清测试不同，暨南大学第二临床医学院孙平华教授/张江林教授及周海波副教授联合报告了一种传感平台，该平台包含可穿戴微针（MN）贴片和三金属Au@Ag-Pt纳米颗粒（NPs），用于表面增强拉曼散射（SERS）和比色双模式原位检测人类皮肤中的TYR，以实现潜在的黑色素瘤筛查。在TYR存在的情况下，固定在MN上的邻苯二酚优先被氧化为苯醌，竞争性地阻碍MN与Au@Ag-Pt NPs的相互作用，触发SERS−比色信号开关。使用B16F10小鼠黑色素瘤模型，本平台能够在抗PD-1抗体治疗之前和治疗期间无创穿透皮肤表面并检测TYR水平，这为黑色素瘤的预后判断和疾病监测提供有用的信息。通过原位传感预先捕获TYR代谢变化，该平台成功应用于区分黑色素瘤受试者和正常痣，以及从乳酸脱氢酶（LDH）阴性患者中筛选潜在的黑色素瘤。黑色素瘤的生长和预后仍然可以通过记录TYR水平的持续变化来监测。此外，MN贴片具有柔性和可拉伸特性，可以牢固地粘附在皮肤上，而不会引起化学或物理刺激。该平台整合了基于MN的原位传感、TYR响应性和SERS/比色双读出策略，将在皮肤黑色素瘤的早期诊断和监测中具有很高的临床重要性。相关研究内容于2023年10月4日以“In Situ Tyrosinase Monitoring by Wearable Microneedle Patch toward Clinical Melanoma Screening”为题发表在《ACS Nano》上。

本研究开发了可穿戴的MN三金属Au@Ag-Pt NPs，用于TYR的原位检测，用于潜在的黑色素瘤筛查（示意图C、D），旨在帮助全科医生和没有经验的皮肤科医生区分黑色素瘤和可疑病变，并减少不必要的活检。多巴胺修饰MN阵列，多巴胺含有邻苯二酚，用于与拉曼报告基因4-巯基苯基硼酸（4-MPBA）标记的Au@Ag-Pt纳米酶（M/Au@AgPt）相互作用，通过稳定的环硼酸酯形成MN/M/Au@Ag-Pt平台（示意图B）。聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具制造多巴胺修饰的MN的详细步骤见示意图A。

示意图 (A)MN贴片的制备工艺示意图；(B)基于MN的Au@Ag-Pt NPs原位检测TYR的原理；(C)动态监测TYR水平，以筛查志愿者和黑色素瘤患者的皮肤痣；(D)双模型检测黑色素瘤患者血清和皮肤中TYR水平的研究。

【MN的合成与表征】

所制作的MN阵列被组装成一个弯刀状贴片（图1A），这使得它很容易与皮肤接触，特别是一些难以覆盖的黑色素瘤区域，如踝关节、脚趾甲和脚跟（图1F）。明场、扫描电镜（SEM）及共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像显示所制作的MN表现出规则的矩形金字塔几何形状，尖高600 μm，直径300 μm，两个相邻中心之间的距离为600 μm（图1B-D）。经过扭转和弯曲试验后，MN贴片能够承受机械变形，并能很好地保持其形态（图1E）。在反复冲击皮肤的过程中，MN阵列仍然保持其完整性（图1G）。MN产生的微孔在20 min内几乎被重新密封，皮肤斑点在30 min内完全恢复到原始状态（图1H），对皮肤的侵袭性最小。组织学切片分析显示其穿透深度约为300μm（图1I），表明MN成功地穿透角质层和表皮，但没有到达真皮。

图1 MN的合成与表征

【M/Au@Ag-Pt NPs的合成与表征】

采用种子介导的方法和电偶置换反应策略合成Au@Ag-Pt纳米棒的过程如下（图2A）。Ag-Pt壳层的还原生长使其形态从球形Au@Ag转变为棘齿状Au@Ag-Pt，结合黄色转变为棕红色的特征（图2D），表明粒子从25 nm到35 nm有明显的尺寸变化。通过控制Ag壳的厚度，发现随着Pt壳层厚度的增加，Au@AgPt纳米棒的结构和尺寸发生明显的变化（图2B），其中，核和壳之间的中空内部尺寸进一步增大，外部Pt颗粒逐渐生长和积累，形成一个完整的Pt壳。Au@ Ag-Pt NPs的能量色散X射线（EDX）映射清楚地显示Au、Ag和Pt以及核心−间隙−壳结构中合并元素的化学分布（图2C）。图2E中整个区域的线扫描轮廓进一步证实外双金属壳层同时由Ag和Pt组成。如高分辨率的Ag 3d区域XPS谱所示，在373.2和367.2 eV处出现一对峰，分别对应于金属态下的Ag 3d_3/2和Ag 3d_5/2（图2F）。同时，Pt 4f区域在结合能分别为70.7和74.2 eV时出现两个光电子峰，这是由于金属态下的Pt 4f_7/2和Pt4f_5/2（图2G）。1580cm⁻¹记录的SERS峰值的相对强度证明最佳的SERS性能来自M/ Au@Ag7-Pt NPs（图2H）。随着Ag-Pt合金壳层厚度的增加，蓝色不断加深，达到从Au@Ag7-Pt到Au@Ag11-Pt的稳定性，因为Pt原子几乎覆盖所有的Au@Ag表面，导致TMB催化饱和（图2I）。

图2 M/Au@Ag-Pt NPs的合成与表征

【MN/M/Au@Ag-Pt平台TYR检测的可行性和灵敏度】

由于4-MPBA的硫醇基团在硼酯形成之前与贵金属金属纳米材料表面强烈结合，为了精确测定HRMS，测定苯基硼酸（PBA）与儿苯二酚之间的相互作用，以证明4-MPBA与多巴胺之间反应的可行性（图3A）。与TYR孵育后，电离片段的强度比峰值增加约3倍（图3B），说明TYR催化苯酚转化，大大增加苯醌比例。如图3C所示，当MN和Au@Ag-Pt NPs之间缺乏4-MPBA时，无论有没有TYR，几乎没有SERS信号，推断裸Au@Ag-Pt NPs不能停留在MN上。SEM图像进一步证实M/Au@Ag-Pt NPs聚集在MN表面，而M/Au@Ag-Pt NPs的数量随着TYR的催化作用而急剧减少，从而验证这种传感策略的可行性（图3D）。SERS映射图像显示，一个统一的信号输出显示在不同的MN（图3E）。

图3 MN/M/Au@Ag-Pt平台TYR检测的可行性和灵敏度

【TYR检测的体外皮肤模型】

由于皮肤细胞与TYR的相互作用，在TYR浸润24 h后，皮肤颜色由粉红色变为深棕色（图4A）。随着TYR浓度的增加，SERS信号随着比色信号的出现而降低（图4B、C），在强度峰和特征峰上与图3F、G得到的结果相似。图4D为SERS/UV vis峰值强度与猪皮肤中TYR的对数浓度的曲线图。只有在目标TYR存在的情况下，才能观察到SERS信号下降和比色信号增加，而其他物种的信号与空白组没有明显差异（图4E）。随着抑制剂浓度的增加，SERS信号迅速恢复，而比色强度逐渐变弱（图4F、G），说明酶抑制剂抑制的TYR活性不能如预期的那样催化邻苯二酚转化为苯醌。在测定条件下，TYR抑制剂（苯甲酸）的半抑制浓度值约为1.1mM（图4H）。SEM图像显示，在TYR存在的情况下，MN上残留的M/Au@Ag-Pt NPs较少，而在苯甲酸干扰后，大部分沉积在MN上（图4I），进一步证明上述SERS/比色结果。综上，这些抑制实验进一步证实基于MN的探针在体外检测TYR的可行性和特异性。

图4 TYR检测的体外皮肤模型

【TYR检测的体内皮肤模型】

图5A显示了粘附在小鼠皮肤上前后的MN，只有黑色素瘤小鼠有肉眼可见的色素斑点区域。从小鼠皮肤中去除MN后，与其他肿瘤模型相比，M/Au@Ag-Pt NPs可以很容易地在黑色素瘤皮肤中找到TYR（图5B）。免疫荧光染色显示TYR水平在黑色素瘤中高表达，并证实该平台在黑色素瘤筛查中的成功应用（图5C）。在黑色素瘤病灶中发现过量的TYR，而在血清中发现的数量较少（图5D）。在接种黑色素瘤细胞后，每2天给予诱导肿瘤持久消退的抗PD-1抗体，而空白组只注射生理盐水（图5E）。TYR水平在接种开始时缓慢增加，在接种9天后显著增加（图5F、G），这是肿瘤生长进展的结果。除肿瘤组织外，肝脏和肺的TYR水平远高于其他未受影响的器官（图5H），提示黑色素瘤可快速转移到这些器官。

图5 TYR检测的体内皮肤模型

【用于TYR检测的临床人体样本】

将MN贴片穿透可疑的异常皮肤痣发现，与正常皮肤相比，皮痣中TYR的表达略有升高，而在黑色素瘤患者中异常升高（图6A）。SERS/比色分析的曲线下面积（AUC）分别为0.875和0.773（图6B），表明该平台在建立诊断模型和良恶性分类方面具有良好的性能。为进一步了解个性化受试者的动态TYR水平，对基于MN传感平台在相同条件下的两个皮肤痣志愿者和黑色素瘤患者身上的性能进行表征，结果证实2例黑色素瘤患者的TYR水平较高，且随着时间的推移而稳步上升（图6E−H）。原位监测人类皮肤中的TYR水平（示意图D），发现在SERS和比色测量中，皮肤中TYR浓度都远远高于血清中浓度（图6C、D）。在随后对切除标本的回顾中，在黑色素瘤皮肤组织的早期阶段明显观察到TYR的过表达（图6J）。进一步应用于LDH阴性黑色素瘤患者和LDH阳性黑色素瘤患者的检测，结果显示TYR在LDH阴性患者的黑色素瘤皮肤中仍高表达（图6I）。因此，通过整合LDH和TYR分析，它将为皮肤科医生的黑色素瘤监测提供更多有价值的信息。

图6 用于TYR检测的临床人体样本

【总结】

总之，本研究开发了一种集成多金属Au@Ag-Pt传感器的非侵入性可穿戴MN，用于SERS/比色双模式传感黑色素瘤相关生物标志物（TYR）。与以往专注于人类血清检测的研究不同，这项工作为实现人类皮肤TYR检测提供一个有吸引力的替代策略，实现黑色素瘤的早期筛查和诊断。该平台表现出良好的TYR线性关系，拥有超低检测极限。在临床诊断中，所开发的平台可以刺穿可疑的异常皮肤痣，无侵袭性，并成功区分黑色素瘤和良性病变。本研究通过记录TYR水平的动态变化，为监测黑色素瘤的生长和预后提供可能性。更重要的是，这种所提出的SERS/比色双模方法可以很容易扩展到其他皮肤生物标志物的测定，使其适用于各种皮肤病筛查。

原文链接：

https://doi.org/10.1021/acsnano.3c05638