玻尿酸差异化：除了G’和G’’值，原来体现玻尿酸特点的，还有E'和P值！

Hey guys，基于透明质酸（HA）的填充剂是粘弹性凝胶，专门设计用于在注射到真皮和皮下组织的不同深度后消除皮肤凹陷和缺陷。HA凝胶主要是通过化学交联（如BDDE）形成，可以通过改变HA和BDDE的浓度以及分子量，以获得具有独特特性的水凝胶，适用于纠正小皱纹或填充严重的皮肤凹陷。

更具体地说，设计用于皮下注射的填充剂必须能够抵抗由于皮肤张力和面部运动而产生的水平（剪切）和垂直（压缩）力（图1），同时保持皮肤投影，并且过度延伸一段时间。由于这些原因，丰盈填充剂通常被开发为具有较高改性度（MoD）和HA浓度的硬质弹性材料。然而，它们必须能够通过细规格的针（通常为27G）轻松挤出。为了评估其对不同应力的抵抗力，凝胶通常通过流变学来表征，特别强调以剪切力测量的弹性模量，G'。虽然商业填充剂的静态和动态特性已在剪切模式下进行了广泛研究，但它们的抗压缩性和投射组织的能力仍然难以捉摸。迄今为止，只有少数研究评估了凝胶在恒定、正常压缩下的行为。

图1

由于注入深层脂肪室的透明质酸填充剂大多因皮肤张力而受到垂直压缩，关于它们对动态压缩的抵抗力（不同强度的重复垂直压缩循环并通过压缩弹性模量E'进行探测）的附加信息是非常需要的。在本文中，作者首先探讨了五种常用的丰盈填充剂在动态压缩下的行为（通过动态机械分析，DMA），并提取它们的E'作为其抗压缩能力的读数。

更进一步，作者寻求开发一种分析工具来评估凝胶提升组织和抵抗皮肤张力的能力。理想的丰盈填充剂应尽可能长时间地提升组织并保持其厚度，避免需要修补的快速变平以及随后过度填充该区域的风险。因此，作者进行了压缩蠕变测试，整合了时间的概念，更真实地代表了凝胶稳定抵抗皮肤引起的凝胶压扁的能力。迄今为止，只有少数文章评估了水凝胶的蠕变行为，据作者所知，作者的研究是对商业填充剂进行的首次分析。

评估了未交联HA溶液的蠕变行为，发现在几秒钟内完全应力松弛（压平），证实了交联凝胶提供提升能力的必要性。然而，交联、聚合物浓度或制造工艺如何影响凝胶抵抗正常变形的能力尚未阐明。为了填补这一空白，引入了基于凝胶压缩蠕变曲线的新投影指数评分，以在填充剂之间进行比较分析。由于凝胶的提升能力会随着其逐渐吸收而降低，因此作者最终评估了凝胶对酶促降解的抵抗力，以估计其注射后体内的耐久性。

在本文中，作者的目标是扩大可用于表征软组织丰盈剂的分析工具。虽然振荡流变学仍然是黄金标准，但作者的研究首次引入使用投影指数来评估凝胶随时间推移提升组织的能力。

材料和方法

被调查的填充剂名单

表1列出了所研究的填充剂列表。所有这些凝胶都旨在深层注射到脂肪室中，以矫正严重皱纹或增加容量。

表1.本研究中研究的丰盈填充剂列表

压缩模式动弹性模量的测定

凝胶的粘弹性参数是通过DHR2流变仪上的平行板几何形状（40mm阳极氧化铝，TAInstruments，NewCastle，DE，USA）从0.1%到10%（1Hz，25°C）的振荡压缩变形来确定的（TAInstruments，美国特拉华州纽卡斯尔）。对于每次测量，将1.5mL填充剂沉积在Peltier板的中心。间隙设置为1毫米，实验开始。该测试测量压缩时弹性模量和粘性模量在变形范围内的演变，分别为E'和E''。还确定了每个产品的线性粘弹性区域（LVER），代表E'保持恒定的变形范围（保持在准静态条件下测量的初始E'值的至少90%）。

投影指数测量

使用平行板几何形状（40mm阳极氧化铝，TAInstruments，NewCastle，DE，USA）和DHR2流变仪，在2N（1600Pa）恒定压缩力、25°C下进行1小时的容量容量测试。根据初步实验，选择2N的值作为引起测试凝胶逐渐变平所需的最小力。将一克凝胶沉积在Peltier板上，并执行调节步骤，其中包括垂直压缩样品直至达到700µm间隙。当法向力达到2N时，开始记录凝胶厚度随时间的变化。间隙变化限制设置为200µm，以避免实验过程中板之间的直接接触。为了确定平衡时的凝胶厚度，d∞，使用粘弹性材料的广义麦克斯韦模型。然后使用公式（1）确定投影指数（P Idx，以%表示）：

在整个实验过程中，凝胶上覆盖有溶剂收集器，以避免水蒸发和凝胶干燥。与此分析并行，对从猪胁腹皮肤提取的猪脂肪组织盘进行了类似测试。动物牺牲后4小时，当地屠宰场提供并准备组织（瑞士博讷Loëx）。

通过酶降解评估增容剂的持久性

用于多剂量透明质酸酶降解增容剂的方案改编自Flégeau等人。该方案先前开发用于通过流变时间扫描和G'实时测量来评估与透明质酸酶接触的软组织填充剂的降解。简而言之，50μL Hynex溶液（150USPU·mL−1，Halozyme Therapeutics，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国）倒入空注射器中，并使用Luer-Lock连接器与1mL凝胶混合。然后将凝胶沉积到配备锥体（40mm，1°）板几何形状的DHR2流变仪上，并在开始流变时间扫描（0.1%应变，1Hz）之前在37°C下平衡1分钟。每5分钟，将上部几何结构升起，并向凝胶中添加50µL新鲜的Hynex溶液，然后开始另一次时间扫描程序。重复此设置，直到达到增容剂几乎完全降解（设定为G'<30Pa）。

数据呈现

除非另有说明，实验一式三份进行。结果以平均值±标准差表示。

结果

压缩模式下增容剂的粘弹性表征

为了通过实验评估动态压缩对填充剂机械性能的影响，通过流变学评估了压缩时弹性模量E'在0.1-10.0%变形范围内的演变（图2A）。从曲线中提取1%应变下的剪切压缩模量和线性粘弹性区域（LVER）（图2B、C）。即使在适度变形（<1%应变）下，一些填充剂（包括RES LYFT和JUV VOL）的E'模量也出现急剧下降。RHA 4在1%处显示最高E'值，为170,482±8154Pa，其次是BEL VOL、JUV VOL、RES VOL和RESL YFT，E′值分别为127,584±21,203Pa、103,979±3788Pa、92,746±6185Pa和47,819±6185Pa（图2B）。与此同时，不同凝胶的填充剂抵抗压缩应变的能力差异很大。虽然BEL VOL、RES VOL和RHA 4可以抵抗超过其初始高度2.0%的变形，但JUV VOL只能抵抗0.5%的应变，而RES LYFT则没有显示出LVER，其机械性能不断下降（图2C）。

图2.压缩模式下丰盈剂的粘弹性特性

丰盈能力和投射指数测量

所研究的填充剂的投影指数（P Idx）旨在测量其在承受皮肤张力的同时提升组织的能力。为此，进行蠕变压缩测试，以监测在2N恒定法向力下凝胶厚度随时间的变化，对应于1600Pa的压力或在1cm2皮肤上施加16g的质量（图3A）。配置（法向力、间隙和几何形状）经过优化，以避免阻力最小的填充剂立即变平。为了进行比较，对猪皮下皮肤组织进行了类似的测试，以评估脂肪组织抵抗压力的自然倾向。所有填充剂的厚度随着时间的推移逐渐减少，但具有不同的轮廓（图3A）。RESL YFT和JUV VOL凝胶的厚度在压力下立即下降，并在不到2分钟内达到接近稳定状态，这表现出了两种不同的行为。

更具体地说，RES LYFT在不到1分钟的时间内就失去了其初始厚度的一半。相反，RHA 4、RES VOL和BEL VOL以及猪脂肪组织，在1小时内显示其初始厚度逐渐减少，其中RHA 4表现出最接近猪皮肤的行为。为了确定平衡状态下的凝胶厚度，采用了粘弹性材料的广义麦克斯韦模型，并根据方程（1）计算投影指数（图3B）。该参数探测填充物在平衡时的最终厚度，并概述其随着时间的推移投射组织和保持其高度的能力。RHA 4、RES VOL、RES LYFT、BEL VOL和JUV VOL显示P Idx分别为77.8±4.5、63.9±0.8、37.7±1.4、53.2±3.7和65.6±5.1%。相比之下，猪脂肪组织的PIdx为90%。因此，RHA4、JUVVOL和RESVOL显示出最好的抗变形能力，其中RHA4显示出最高且与猪脂肪组织最相似的投射能力。

图3

增容剂对酶降解的抵抗力

为了评估和比较增容剂对酶促降解的抵抗力，使用Hynex人重组透明质酸酶进行了多剂量降解测定，并通过37°C下的流变时间扫描进行监测（图4）。每5分钟重新注射50µL透明质酸酶，直至达到接近完全降解。所有凝胶的弹性模量随着时间的推移逐渐丧失，表明凝胶降解（图4A）。除RES LYFT外，所有凝胶均显示出相似的降解曲线，具有相对线性的降解模式。尽管具有最高的初始弹性模量，RES LYFT注射前两次透明质酸酶后，凝胶的机械性能急剧下降。接下来计算达到30 Pa的G'所需的时间（用作接近完全降解的参考），JUV VOL、BEL VOL、RES LYFT、RES VOL和RHA 4的结果分别为为28.5±2.6、22.3±0.0、22.3±0.0、17.6±0.9和28.1±0.9分钟（图4B）。在测试的填充剂中，JUV VOL和RHA 4显示出最长的持久性。因此，所有凝胶都显示出降解能力，但对酶裂解具有明显的抵抗力。

图4.HA的多剂量酶促降解

讨论

只有小范围的HA和交联剂浓度才能有效配制凝胶，人们很容易认为所有丰盈填充剂都会表现出类似的行为。到目前为止，在测试商业填充剂时获得了非常独特的流变学和物理化学性质。这些差异主要源于制造技术，深刻影响临床结果，从而激发了这项比较研究。

如今，剪切弹性模量（G'）是评估凝胶刚度的常用方法，描述了凝胶在受到侧向力时储存能量而不会发生不可逆变形的能力，并被报告为准静态应力。然而，为了更好地再现自然条件，作者评估了水凝胶的弹性模量E'，描述了凝胶在动态压缩中的刚度。应用广泛的应变来覆盖面部动态表情的全谱，不仅描述了几乎静态条件下的凝胶行为，就像通常报告的G'值一样，但并不代表真实的临床条件。

尽管指示相似，但RES LYFT凝胶之间存在明显差异无法承受哪怕是很小的变形（0.1%应变），而其他填充剂在更动态的环境中保持稳定，一旦注射，可能会提供不同的临床特征。

由于软组织丰盈剂的目标是突出组织，因此作者进一步旨在评估填充剂的提升能力。虽然G'和E'模量提供了对静止状态下凝胶机械阻力的一些理解，但它们并没有探究皮肤张力对水凝胶的时间依赖性影响。迄今为止，只有动物模型、体内3D成像和患者视觉量表提供了临床前和临床阶段凝胶提升能力的最终评估。尽管人们对促进上游创新和临床前开发有着极大的兴趣，但评估组织投射的体外研究仍有待开发。为了捕捉皮肤张力对凝胶的时间依赖性影响，作者进行了压缩蠕变测试，评估凝胶在恒定压缩力下如何变平。施加的垂直压力大致相当于铅笔放在1cm2皮肤上的压力。作为参考标准，作者评估了通常注射丰盈填充剂的猪脂肪组织的蠕变曲线，即脂肪室中。

有趣的是，凝胶抵抗压缩的能力与报道的G'值无关，也与HA浓度或MoD无关。RES LYFT和JUV VOL几乎瞬间变形，直到达到下降的平台。RES LYFT的应力松弛程度最大，JUV VOL的应力松弛程度更有限，并且取决于施加的初始力。相反，BEL VOL、RES VOL和RHA 4显示出更渐进的应力松弛曲线，正如粘弹性组织中常见的那样。

作者假设这些不同的特征可能源于它们的配方和质地的变化。具有较差互连交联颗粒的凝胶（例如NASHA技术）往往会通过源自颗粒重排的快速能量耗散而迅速松弛。相反，具有更加缠结和均匀网络的凝胶大多通过链重排来松弛，从而减慢应力松弛。正如在猪皮肤中观察到的那样，粘弹性组织倾向于通过胶原纤维重排、水运动和游离HA非共价相互作用逐渐松弛。尽管如此，作者发现这种松弛曲线比所有测试的凝胶都慢，显示出脂肪组织抵抗变形的能力。有趣的是，RHA 4、RES VOL和BEL VOL显示出与猪皮肤最接近的行为，且投影指数最高。尽管采用不同的工艺制造，上述凝胶比“颗粒”凝胶具有更多“单相”方面。一些参数，例如颗粒尺寸和凝胶的内聚力，部分解释了这些差异。此外，众所周知，高分子量聚合物的应力-松弛速度比低分子量聚合物慢]。因此，更好地保留HA分子量的制造工艺（如RHA4所示）可能比其他对聚合物影响更严重的技术具有竞争优势。

HA填充剂还需要尽可能长时间地支持组织提升，以维持适当的临床持续时间以使患者满意，特别是在丰盈填充剂的情况下。相反，在紧急情况下，填充剂必须通过外源透明质酸酶的作用保持自然可吸收和可降解性。为了评估它们抵抗降解的能力，最终根据先前发布的方案进行了多剂量降解测定。在体外，使用多次注射小容量透明质酸酶即可完全降解所有凝胶，其中JUVVOL和RHA4显示出最高的持久性和RESVOL最快的降解。这与最近发表的一篇文章一致，该文章表明，小鼠皮下注射物理水凝胶的较长临床持久性已被证明与蠕变减少相关，或者换句话说，与较高的投射指数相关。同样，与MoD或HA浓度没有直接相关性，这凸显了制造工艺对最终凝胶特性的核心作用。值得注意的是，其他因素，例如吞噬作用和活性氧，也有助于凝胶吸收。例如，LaGatta等人评估了与活性氧（ROS）接触的增容剂的降解情况。而RHA 4和RES LYFT显示出渐进的降解率，JUV VOL在暴露于ROS后迅速降解。因此，水凝胶可能对不同的降解机制具有不同的敏感性。

这项体外研究的潜在局限性与实验结果直接转化为临床证据有关。值得注意的是，即使对于具有相似适应症的一类类似产品（本文中的丰盈填充剂），填充剂也不是均匀地使用在相同的精确层中、具有相同的注射量和相同的注射技术，从而使得直接临床比较困难。例如，RHA 4具有独特的能力，既可以用作浅层脂肪室的动态丰盈填充剂，也可以用于骨膜上注射。相比之下，大多数静态丰盈填充剂只能注射到靠近骨骼的位置。因此，这项体外研究旨在为高效的上游创新提供指导。

作者的研究明确强调了在制造过程中限制HA降解的好处，以保留HA固有的生物力学特性并更忠实地适应现实生活条件，即提供高机械抗应力性（E′），高投影能力（PIdx）和高产品持久性。未来的研究应该评估人体皮下组织在压力下如何变形，以及透明质酸填充剂是否可以部分恢复老年人皮肤的天然机械行为。

参考文献

1. Flégeau K, Jing J, Vantou C, Brusini R, Bourdon F, Faivre J. Strengthening the Key Features of Volumizing Fillers: Projection Capacity and Long-Term Persistence. Pharmaceutics. 2023 Nov 4;15（11）:2585. doi: 10.3390/pharmaceutics15112585. PMID: 38004564.